Recepšu RNS

Tas ir šampanietis visiem. Fils Zamors izvelk korķi no Montaudon pudeles, noslapinot pilnīgi jauno paklāju. Ikviens viņa laboratorijā piepilda glāzi, lai uzskanētu priekšniekam. Negaidītas labas ziņas, viņš skaidro. Zamore, Masačūsetsas Universitātes Medicīnas skolas Vorčesteras bioķīmiķis, tikko piecu gadu laikā saņēmis nacionālo balvu 1 miljona ASV dolāru vērtībā. Laboratorijas budžets tikko trīskāršojās.

Zamore ir saprotams, un tas nav saistīts tikai ar naudu. Zamoras lauks, RNS iejaukšanās jeb RNAi, ir tikai dažus gadus vecs, taču tas ir pārņēmis bioloģijas pasauli. RNAi ir aizraujošākais ieskats bioloģijā pēdējo desmit vai divu gadu laikā, saka Nobela prēmijas laureāts Filips Šārps, MIT biologs. Un Zamoras laboratorija ir viena no tām, kas virza laukumu uz priekšu galvu reibinošā tempā. Es domāju, ka ikviens, kas strādā šajā jomā, jūtas mazliet aizelsis no progresa, saka Zamore.

Šis stāsts bija daļa no mūsu 2002. gada decembra numura

• Skatiet pārējo izdevuma daļu
• Abonēt

Zamore, Sharp un citu pētnieku kopīgā sajūsma ir pamatota. Gadu desmitiem ilgi pētnieki domāja, ka RNS ir tikai DNS vēstnesis, kas verdziski piegādā DNS proteīnu rasējumus. Bet tagad šķiet, ka sīkas dubultās RNS virknes, kas ievadītas laboratorijā audzētās šūnās vai dzīvniekos, var ātri un efektīvi izslēgt jebkuru gēnu.

Sekas ir elpu aizraujošas, jo dzīvos organismus lielā mērā nosaka izsmalcināti organizēta gēnu ieslēgšana un izslēgšana. Biologi līdz šim ir spējuši atdarināt šo pārslēgšanas procesu tikai lēnā, apgrūtinošā un netiešā veidā. Bet tas, cik viegli RNAi var izslēgt gēnus, pēc pētnieku domām, šķiet gandrīz mistisks. Laboratorijas metodes, kurās izmanto RNSi, jau ir biologu izvēles metodes, lai atklātu noteiktu gēnu funkcijas. Un tas sola jaunu veidu, kā tieši ārstēt slimības, izslēdzot galvenos gēnus, kas saistīti ar dažādām slimībām. Jau tagad vismaz astoņi uzņēmumi, tostarp Zamore, Sharp un kolēģi dibinātie uzņēmumi, strādā pie RNAi terapijas visam, sākot no vīrusu slimībām līdz vēzim.

Zamore saka, ka Svētais Grāls to visu pārvērš par narkotikām. Lai varētu dot jums nelielu traucējošu RNS, kas izslēgtu jūsu augsta holesterīna gēna ekspresiju. Tas pazeminātu C hepatīta līmeni, kas inficē jūsu aknas. Vai varbūt, es domāju, ka, iespējams, lielākajā lietojumprogrammā, kas var izmantot audzēja šūnām raksturīgu gēnu un iznīcinātu audzēju.

Tas, cik ātri tas varētu notikt, var minēt. RNS traucējumi ielauzās zinātniskās pasaules apziņā ikgadējā RNS biedrības sanāksmē Banfā, Albertā, 2001. gada maijā. Saida Elbašira, pēcdoktore bioķīmiķa Tomasa Tušla laboratorijā Maksa Planka Biofizikālās ķīmijas institūtā 2001. gada maijā. Gtingenā, Vācijā, savus klausītājus pārsteidza ar ziņu, ka sīki divpavedienu RNS fragmenti ātri, viegli un īpaši izslēdza gēnus cilvēka šūnās, un pētnieki nekad iepriekš nebija redzējuši RNS spēlēšanu.

Lielākā daļa klausītāju vienkārši sēdēja un sacīja: Zinātne ir tikko mainījusies,” atceras Mičiganas Universitātes bioķīmiķis Deivids Engelke. Vienīgais, kas novērsa pandemoniju, bija tas, ka mums jau iepriekš tika apsolīta šāda veida lieta. Skeptiski noskaņotais Engelke gaidīja dažus mēnešus. Tad sāka ienākt šie ziņojumi: Ak, tas tiešām darbojas!

RNS pārsteigums

Vēl nesen biologi RNS bija piešķīruši diezgan neglaimojošu lomu kā pasīvā vēstneša loma, kas nogādā ģenētisko informāciju no DNS uz šūnas proteīnu ražošanas mehānismu. Šajā procesā gēna DNS kods tiek pārrakstīts RNS kopijā, ko šūnu iekārta pārvērš proteīnā. RNS traucējumu gadījumā īsi RNS biti bloķē procesu, iznīcinot ziņojumu ceļā. Divpavedienu RNS fragmenti ved griešanas enzīmus uz RNS, kas nes ģenētisko vēstījumu. Pēc tam ziņojuma RNS tiek sasmalcināta un marķēta iznīcināšanai: gēna ziņojums tiek efektīvi apklusināts.

Biologi jau gadiem ilgi ir zinājuši, ka vienpavedienu RNS molekulas, kas paredzētas savienošanai ar kurjeru RNS, var pārtraukt olbaltumvielu ražošanu, taču šis mākslīgais process ir neuzticams pat laboratorijā. Daba tomēr regulē gēnus, izmantojot RNS, īpaši divpavedienu molekulas.

Pirmie mājieni par šo parādību parādījās tālajā 1990. gadā, taču tajā laikā pētnieki nesaistīja novēroto ar RNS. Tajā gadā augu biologs Ričs Jorgensens, kas toreiz strādāja no DNS Plant Technology Ouklendā, Kalifornijā, centās padarīt purpursarkanās petūnijas ar dziļāku purpursarkanu nokrāsu. Viņš ievietoja jaunu, uzlādētu gēna kopiju, kas kontrolē purpura pigmenta veidošanos. Viņam par pārsteigumu viņš ieguva baltas petūnijas. Jorgensens atzina šī paradoksālā efekta nozīmi, taču viņš nevarēja izskaidrot, kāpēc, pievienojot vairāk gēna, šis gēns tika izslēgts.

Nākamais pavediens radās 1995. gadā, kad Kornela universitātes ģenētiķi klonēja gēnu mikroskopiskā augsnes tārpā. C. elegans . Lai pārbaudītu savu atklājumu, viņi izmantoja standarta laboratorijas metodi, lai izslēgtu gēnu: viņi pievienoja vienu RNS virkni, kas atbilda ziņojuma RNS. Šī komplementārā virkne saistās ar kurjeru, neļaujot tai pārvērsties olbaltumvielās. Negaidīti gēnu izslēdza arī viena nekomplementāra RNS virkne, ko viņi izmantoja kā eksperimentālu kontroli un kurai nevajadzēja darīt neko.

1998. gadā bioķīmiķis Endrjū Fīrs, kas toreiz strādāja Vašingtonas Kārnegi institūtā, un ģenētiķis Kreigs Mello Masačūsetsas Universitātes Medicīnas skolā atrisināja šo noslēpumu. Injicējot tārpos komplementāras atsevišķas RNS virknes, tie ieguva pārsteidzoši spēcīgu trokšņa slāpēšanas efektu, kad abas virknes apvienojās. Pēc tam, kad tika parādīts, ka divpavedienu RNS ir īstais trokšņa slāpētājs, Fire un Mello radīja terminu RNS traucējumi, un radās jauns lauks. Retrospektīvi, Jorgensena pārlādētie purpursarkanie gēni radīja divpavedienu RNS, kam bija tāda pati ietekme uz vietējiem purpursarkanajiem gēniem, būtībā tos izslēdzot.

Šķita, ka divpavedienu RNS nodrošina stabilāku un uzticamāku līdzekli konkrētu gēnu izslēgšanai nekā atsevišķas pavedieni, un laboratorijas, kas pētīja organismus, tostarp augus, tārpus un mušas, labprāt pieņēma jauno metodi. Tomēr RNS iejaukšanās zīdītājiem nedarbojās: imūnsistēma iznīcina šūnas, kas satur divpavedienu RNS, lai aizsargātos pret RNS vīrusiem, piemēram, tiem, kas izraisa A un C hepatītu. Pēc tam nāca Tušla un Elbašira atklājums Banfā, ka RNS segmenti ir ļoti īsi, ko viņi nodēvēja par mazo traucējošo RNS, darbojās cilvēka šūnās. Tajā brīdī, saka Sharp, viss laukums pacēlās.

Klusā ārstēšana

Tagad izmeklētāji meklē veidus, kā pārvērst šo spēcīgo jauno RNS lomu uzņēmuma peļņā. Praktiski visi zāļu uzņēmumi jau izmanto RNS traucējumus kā līdzekli zāļu atklāšanai. Viena no populārākajām stratēģijām jaunu narkotiku mērķu atrašanai ir gēnu izslēgšana vai atspējošana pa vienam, lai redzētu, kas notiek. Ja, piemēram, slimu dzīvnieku var izārstēt, izsitot noteiktu gēnu, šī gēna proteīns varētu būt labs narkotiku mērķis. Izmantojot mazas traucējošas RNS, izrādās, var radikāli paātrināt šo procesu. Tā vietā, lai tērētu mēnešus vai gadus, lai izstrādātu nokautu, pētnieki izmanto RNS, lai īpaši un ātri izslēgtu gēnu. Viņi var arī novērot, vai proteīna kā zāļu izslēgšana neizraisa blakusparādības. Process notiek dažu dienu laikā, nevis gadā, saka Kristofs Ečeverri (Christophe Echeverri), biotehnoloģiju uzņēmuma Cenix BioScience izpilddirektors Drēzdenē, Vācijā.

Galīgajā pielietojumā nelielas traucējošas RNS pašas var būt zāles: nevis bloķēt noteiktu proteīnu, kā to dara standarta zāles, bet gan novērst proteīna veidošanos. Pagājušā gada jūnijā MIT Sharp parādīja, ka šādas RNS, kas vērstas uz galvenajiem vīrusu un cilvēka gēniem, var apturēt HIV infekciju laboratorijā audzētās šūnās. Vienā eksperimentā pētnieki sajauca ar HIV inficētas šūnas ar mazām traucējošām RNS, kas vērstas pret vīrusu gēniem. RNS apturēja vīrusu vairošanos. Sharp grupa arī sajauca neinficētas šūnas ar mazām traucējošām RNS, kas vērstas uz CD4, proteīnu uz šūnu virsmas, caur kuru HIV iekļūst. Pētnieki parādīja, ka RNS samazināja CD4 ražošanu. Pēc divarpus dienām viņi pakļāva ar RNS apstrādātas šūnas un neapstrādātas šūnas HIV. Vīruss inficēja četras reizes vairāk neapstrādātu šūnu.

Neskatoties uz iepriecinošajiem rezultātiem, pagaidām RNAi zāles joprojām ir sapņu stadijā, saka Šārps. Taču Šārps uzskatīja, ka agrīnais solījums ir pietiekami vilinošs, lai kopīgi ar Zamoru, Tušlu un diviem citiem zinātniekiem - Alnylam Pharmaceuticals Kembridžā, MA, izstrādātu šādas zāles. Uzņēmums tikko sāka darboties, kad pagājušā gada jūlijā nodrošināja riska kapitāla finansējumu 17 miljonu ASV dolāru apmērā.

Tomēr RNAi zāļu izgatavošana nebūs vienkārša. Pirmkārt, neviens nav atradis metodes, kas būtu piemērotas RNS ievadīšanai cilvēkiem. Ir piegādes problēma. Tas ir tik vienkārši, saka Hārvardas universitātes ķīmiķis Stjuarts Šraibers. Nukleīnskābju nokļūšana mērķa audos [ir] neatrisināta problēma medicīnā. Šreibers saka, ka RNAi terapija būtībā ir gēnu terapija, un tā saskarsies ar tām pašām problēmām - neefektivitāti, neefektivitāti un imunoloģiskām blakusparādībām, kas šajā jomā ir apstājušās kopš 1999. gada, kad Džese Gelsingers nomira gēnu terapijas izmēģinājuma laikā Pensilvānijas Universitātē. Ārsti izmantoja modificētus vīrusus kā piegādes līdzekļus vai vektorus, lai DNS pārnestu pusaudža šūnās. Gelsingera imūnsistēma reaģēja masveidā un nāvējoši.

Sharp saka, ka cerība ir tāda, ka mazai traucējošai RNS, iespējams, nebūs vajadzīgi vektori, lai sasniegtu savu mērķi, tādējādi izvairoties no lielākās daļas ar DNS balstītu gēnu terapiju saistīto kļūmju. Bet šis scenārijs nebūt nav skaidrs. Vai varat modificēt RNS, lai padarītu tās stabilākas [un], lai šūnas tās uzņemtu efektīvāk? Sharp jautā. Mēs nezinām.

Jēga

Jaunākā biomedicīnas vēsture nepalīdz atrisināt nenoteiktību. Faktiski šī nav pirmā reize, kad zinātnieki ir mēģinājuši izveidot zāles, kuru pamatā ir RNS klusēšana. Vienpavedienu antisense RNS vai DNS var arī izslēgt gēnus, un tai nav nepieciešams vektors. Šūnas iekšienē antisense molekula atrod savu komplementāro ziņojuma RNS, un, tāpat kā abas rāvējslēdzēja puses, tās cieši saistās, neļaujot ziņojuma RNS iziet cauri šūnas proteīnu ražošanas iekārtai. Rezultāts, vismaz teorētiski, ir gēnu izslēgšana.

Tomēr antisense līdz šim ir bijusi vilšanās kā jaunu zāļu pamats. Pēc vairāk nekā desmit gadus ilga intensīva izstrādes darba tikai viena antisense zāle - Isis Pharmaceuticals Vitravene noteiktu retu acu infekciju ārstēšanai AIDS pacientiem - ir ieguvusi Pārtikas un zāļu pārvaldes apstiprinājumu. Pirmās paaudzes antisense zāles, kas tika pārbaudītas 90. gadu sākumā, organismā strauji noārdījās, bija grūti iekļūt šūnās, bieži vien nespēja atrast savu mērķi un izraisīja smagas blakusparādības. Tagad stabilākas antisense zāles tiek pārbaudītas ar cilvēkiem.

Vai RNSi var darboties labāk nekā antisenss? Ne tik drīz, prognozē Frenks Benets, Isis antisensu pētījumu viceprezidents. Ja salīdzina RNAi ar pašreizējo antisense versiju, tad tiešām nav nekādu priekšrocību, viņš saka. [Mazie traucējošie] RNS tehnoloģija patiešām ir sākuma stadijā. Tas ir nedaudz līdzvērtīgs tam, kur antisense bija pirms 10 gadiem, kad mēs tikko sākām veikt eksperimentus ar dzīvniekiem.

Bet RNAi cilvēki uzskata, ka viņu tehnoloģija būtiski atšķiras no antisensa. Liela RNAi priekšrocība salīdzinājumā ar antisensu ir tā, ka, lūk, tas patiešām darbojas, saka Cenix izpilddirektors Echeverri. Viņš saka, ka RNAi ir daudz spēcīgāks un uzticamāks nekā antisenss. Viņš saka, ka Antisense projekti parasti tika uzskatīti par pašnāvības projektiem. Jūs varētu pavadīt daudz laika, lai tas darbotos, un tas nekad nedarbosies. Jums nepaliktu nekas, ko parādīt. Echeverri uzskata, ka RNAi lielākajai iedarbībai vajadzētu nodrošināt labākas terapijas. Un, tā kā gēna apklusināšanai būs nepieciešams mazāk zāļu, vajadzētu būt mazākām blakusparādībām.

Cilvēki ir cīnījušies ar antisensu, un šī ir tehnoloģija, kas patiešām darbojas, piekrīt Džons Volfs, RNS terapijas uzņēmuma Mirus galvenais zinātniskais darbinieks Medisonā, WI. Antisense ir grūti reproducēt, bet RNAi ir kaut kas tāds, kas darbojas tieši no mucas.

Bet vai RNAi varētu būt tikai vēl viena pārmērīga tehnoloģija? Pierādījums ir pudiņā, saka Ečeverri. Pēdējo divu, trīs gadu laikā RNAi ir tikko pilnībā pārņēmis vadību. Visi pievēršas tai; katrā organismā viņi to izmēģina. Un tas nebūtu tik populārs, ja tas nebūtu veiksmīgs.

Apklusināt šaubas

Neviens vēl nav izmēģinājis RNAi cilvēkiem, taču viens uzņēmums ir tuvu: Ribopharma, biotehnoloģiju starta uzņēmums Kulmbahā, Vācijā. Vairāk nekā gadu pirms Tuschl grupa pārsteidza zinātnieku aprindas ar jaunumiem, Ribopharma dibinātāji, bijušie Baireitas universitātes pasniedzēji Rolands Kreicers un Stefans Limmers atklāja, ka mazas RNS darbojas zīdītāju šūnās. Vai tā apgalvo Kreicers un Limmers. Viņi nekad nav publicējuši savus datus.

Kreicers un Limers uzskatīja, ka ļoti garajām RNS, piemēram, tām, kuras izmantoja Fire un Mello, fiziski nav iespējams saistīties ar savām mērķa RNS. Pielīp tikai īsi segmenti. Tāpēc viņi mēģināja apklusināt zīdītāju gēnus, izmantojot pietiekami īsas RNS, lai izvairītos no letālās imūnās atbildes. Tās bija azartspēles, saka Limers. Un izrādījās, ka tas tiešām darbojas. Pētnieki iesniedza patenta pieteikumu, pameta pasniedzēju darbu un 2000. gada jūnijā nodibināja Ribopharma.

Ribopharma vadītāji nākamgad plāno sākt izmēģinājumus ar cilvēkiem, iespējams, sākot ar mazu traucējošu RNS testiem ļaundabīgas melanomas un aizkuņģa dziedzera vēža ārstēšanā. Kreicers un Limmers saka, ka viņu RNS konstrukcijas ir pietiekami stabilas, lai darbotos bez vektoriem, un tās var injicēt tieši audzēja vietā vai asinsritē. Uzņēmums ir piesaistījis vairāk nekā 18 miljonus ASV dolāru. Taču, tā kā Ribopharma vēl nav publicējusi savus rezultātus, ir grūti novērtēt tās apgalvojumus, saka citi RNS pētnieki. Viņi ir veikuši dažas lietas, saka MIT's Sharp, diezgan labi…[Bet] tas ir garš ceļš.

Cik ilgi? Attieksme svārstās no Ribopharma stingrajiem apliecinājumiem līdz spēcīgam pesimismam. Deivids Bīčs, RNAi starta uzņēmuma Genetica prezidents Kembridžā, MA, norāda uz antisense gadu desmitiem un vairāk odiseju. Es nevēlos sēdēt un strīdēties, ka RNAi izvietošana terapeitiskā režīmā būtu vienkāršāka, viņš saka.

Daudz skaidrāks ir tas, ka RNAi liek biologiem pārdomāt RNS lomu. Dažu pēdējo gadu laikā pētnieki ir atraduši simtiem gēnu, kas kodē mazas RNS molekulas, sauktas par mikroRNS, organismos, sākot no augiem un tārpiem līdz cilvēkiem. Tāpat kā to mazie traucējošie RNS radinieki, šķiet, ka mikroRNS apklusina gēnus, taču to loma bioloģijā lielākoties nav zināma. Daudzi no tiem evolūcijas gaitā ir ļoti saglabājušies; [tātad] viņi dara kaut ko svarīgu, saka MIT biologs Deivids Bartels. Tikmēr apziņa, ka RNSi ir dabisks un, iespējams, fundamentāls process augos un dzīvniekos, ir palīdzējis to padarīt par vienu no aizraujošākajiem mūsdienu bioloģijas noslēpumiem.

Sīkie RNS gēni var būt tumšās matērijas bioloģiskais ekvivalents — visapkārt, bet gandrīz neizbēgami no atklāšanas, 2001. gadā žurnālā rakstīja Hārvardas Medicīnas skolas molekulārais biologs Gerijs Ruvkuns. Zinātne . Ko dara šie noslēpumainie gēni? Man ir aizdomas, ka tas, ko mēs skatāmies, ir ļoti sena gēnu ekspresijas kontroles metode, saka Zamore.

Ja mikroRNS ir slēdži, kas izlemj, vai cilmes šūnas kļūst par neironiem vai muskuļiem, vai vēža šūnas aug vai mirst, tad RNS iejaukšanās ir daudz svarīgāka, nekā to varēja iedomāties tikai pirms dažiem gadiem. Mēs vienkārši uzdūrāmies pilnīgi jaunai molekulārās bioloģijas nozarei, par kuru mēs iepriekš nezinājām, saka Mičiganas Engelke.

Optimistiem šie sasniegumi liecina par ātru efektīvu zāļu izstrādi. Un pat biomedicīnas pētnieki, kurus ciniski padarījuši ekstravagantie apgalvojumi par maģiskiem līdzekļiem, domā, ka RNSi var būt īstā lieta. Pagājušajā gadā, kad RNAi pirmo reizi darbojās cilvēka šūnās, visi pamodās un teica: Interesanti, vai tā ir sudraba lode?’ stāsta Engelke. Un tā varētu būt. Tas varētu būt.

Uzņēmumi, kas izstrādā RNS traucējumus UZŅĒMUMS PRIMĀRAIS RNAi FOCUS Alnylam Pharmaceuticals
(Kembridža, MA)
Terapeitiskie līdzekļi Benitec
(Brisbena, Austrālija)
Intelektuālais īpašums genomikai un terapijai Cenix BioScience
(Drēzdene, Vācija)
Zāļu mērķa noteikšana un vēža terapija Devgen
(Gente, Beļģija) Zāļu mērķa noteikšana un terapija diabēta, depresijas un Parkinsona slimības ārstēšanai Ģenētika
(Kembridža, MA)
Zāļu mērķa noteikšana vēža ārstēšanai Mirus
(Medisona, WI)
Terapeitiskie līdzekļi, izmantojot garu divpavedienu RNS ribopharma
(Kulmbaha, Vācija) Terapeitiskie līdzekļi vēža un C hepatīta ārstēšanai

paslēpties