Secība zibspuldzē

2007. gada 6. februārī 454 Life Sciences vadītāji parādīja 78 gadus vecajam Džeimsam Vatsonam viņa paša genoma pirmo uzmetumu. Tajā bija kaut kas gluži poētisks. Vatsons, protams, pirms 45 gadiem bija ieguvis Nobela prēmiju par lomu DNS dubultspirāles struktūras atklāšanā; viņš bija arī Cilvēka genoma projekta galvenais virzītājspēks, kas līdz tā pabeigšanai 2003. gadā bija iztērējis gandrīz 3 miljardus ASV dolāru 13 gadu laikā, iegūstot šo spirāles kodēto projektu. Tagad uzņēmums 454 ir pavirzījies soli tālāk par šo megaprojektu, kas apvienoja daudzu cilvēku DNS, lai noteiktu cilvēka parauga ģenētisko secību. Uzņēmums un tā sauktā nākamās paaudzes sekvencēšanas iekārta bija vienpersoniski nolasījusi indivīda ģenētisko kodu, kura darbs bija paveicis tik daudz, lai sasniegums būtu iespējams.

Džonatans Rotbergs no 454 uzskata, ka viņa iekārtas padarīs sekvencēšanu tik lētu un ātru, ka būs praktiski nolasīt indivīdu genomus.

Taču Džonatans Rotbergs, kurš nodibināja 454 Brenfordā, CT, ar sapni izveidot sekvencēšanas iekārtu, kas būtu efektīvāka par cilvēka genoma projektam pieejamo, dzeju nepiemin, kad viņš stāsta par savu tikšanos ar Vatsonu. Drīzāk viņš runā par naudu, ātrumu un nākotni, kurā parastie cilvēki diskos nēsā līdzi savus personīgos genomus — tas ir arvien ticamāks scenārijs. Džima Vatsona darbs mums izmaksāja 200 000 USD, norāda Rotbergs. Un mēs to darījām galvenokārt decembrī un janvārī.

Šis stāsts bija daļa no mūsu 2007. gada maija numura

• Skatiet pārējo izdevuma daļu
• Abonēt

Rotbergs, kurš tagad vada 454 direktoru padomi, uzsver, ka projekts Džims joprojām ir nepabeigts un prasīs vairāk laika un naudas. Februārī uzņēmums Vatsona DNS bija sekvencējis tikai trīs reizes (katrs brauciens palielina precizitāti un aizpildīja nepilnības); Lai izveidotu cilvēka genoma projekta galīgo secības uzmetumu, bija nepieciešamas deviņas caurlaides. Bet tāpat.

Rotberga uzņēmums ir tikai viens no vairākiem, tostarp Illumina of Sandjego un Applied Biosystems of Foster City, Kalifornijā, kas izstrādā iekārtas, kas var atšifrēt DNS ātrāk nekā jebkad agrāk. Un tāpat kā datora jaudas izmaksas ir strauji samazinājušās, nepārtraukti pieaugot tranzistoru blīvumam mikroshēmās, DNS sekvencēšanas cena ir strauji kritusies līdz ar šo iekārtu parādīšanos. Mūsdienās cilvēka genoma, kas atšifrēts ar cilvēka genoma projektā izmantotā tipa sekvencēriem, cena būtu 25–50 miljoni USD. Ar šodien pieejamām nākamās paaudzes mašīnām tas samazinās līdz aptuveni 1 miljonam USD, un līdz 2008. gadam tas varētu sasniegt 100 000 USD.

Multivide

• Skatiet secības noslēpumu grafiku.

Kā liecina datoru vēsture, lielāka apstrādes jauda par mazāku naudu var izraisīt neparedzētas lietojumprogrammas. Pēc Cilvēka genoma projekta pētnieki saskārās ar sarežģītiem finansiāliem lēmumiem par to, kurus genomus secināt pēc tam: šimpanzes vai makaka, govs vai delfīna, rīsu vai maniokas. Jaunās iekārtas ļauj secināt gandrīz visu interesējošo. Tā kā arvien vairāk secību datu ieplūst datu bāzēs, tiek atvērtas pilnīgi jaunas pētniecības jomas. Zinātniekiem tagad ir bezprecedenta spēja salīdzināt sugas, izgaismojot visu, sākot no evolūcijas jautājumiem un beidzot ar ģenētiskiem iemesliem individuālām atšķirībām slimību rezistencē un uzņēmībā. Pētījumi, kas veikti ar 454 iekārtām un publicēti populārākajos žurnālos, ietver neandertāliešu genoma daļēju sekvencēšanu un jaunu testu izstrādi vēzi izraisošām ģenētiskām mutācijām — tehnoloģijas, kas var palīdzēt ārstiem pielāgot ārstēšanu saviem pacientiem.

Pagājušais gads ir bijis aizraujošākais periods genomikā kopš Cilvēka genoma projekta laikiem, saka Ēriks Landers, projekta pirmā publicētā cilvēka genoma projekta autors un tagad Plašā genoma medicīnas institūta vadītājs Kembridžā, MA. . Sekvencēšana kļūst pietiekami lēta un pietiekami spēcīga, lai to varētu piemērot jebkurai problēmai. Tas stāv laukam uz galvas. Frensiss Kolinss, kurš vadīja Nacionālo veselības institūtu cilvēka genoma projektu, prognozē, ka jaunajām sekvencēšanas tehnoloģijām būs būtiska ietekme uz biomedicīnas pētījumu nākotni un galu galā arī uz medicīnas praksi.

Unikāls risinājums
Džonatana Rotberga birojā ir ēdnīcas tēma, ar sarkanu un melnu šaha flīžu grīdu, sarkaniem Naugahyde pārklātiem hroma krēsliem un dīvānu ar rokām, kas atdarina 1959. gada Cadillac aizmuguri, komplektā ar monstru astes spurām un lodes formas aizmugurējiem lukturiem. . Rakstāmgalda vietā viņam ir ēdamistabas bārs ar bāra krēsliem. Dažos plauktos rindojas vīna pudeles no viņam piederošā Konektikutas vīna dārza. Aiz logiem atrodas Longailendas skaņa. Vieta kliedz Es esmu unikāls . Un tāds ir arī Rotbergs. 1991. gadā, pabeidzot Jēlas Universitātes doktora grādu bioloģijā, viņš izveidoja CuraGen, vienu no pirmajiem uzņēmumiem, kas izstrādāja zāles, kuru pamatā ir genomika. Papildus CuraGen un 454 Life Sciences viņš ir nodibinājis bērnu slimību izpētes institūtu un vēl vienu biotehnoloģiju uzņēmumu RainDance Technologies, kas ir izstrādājis tā sauktās šķidrās shēmas plates, kas ir paredzētas, lai padarītu eksperimentus efektīvākus, manipulējot ar nelieliem daudzumiem. šķidruma. Un tas viss līdz 43 gadu vecumam.

Patiešām, interese par katras personas unikalitāti galu galā lika viņam mēģināt izveidot sekvencētāju, ar kuru viņš cer, ka kādu dienu genoma pārbaudes padarīs tikpat ikdienišķas kā tagad ir asins analīzes. Rotbergs aiztur 454 mašīnas iekšas, stikla priekšmetstikliņu ar 1,6 miljoniem miniatūru aku, katra aptuveni 50 mikrometrus plata (apmēram puse no cilvēka mata platuma) un 55 mikrometrus dziļa. Tieši šī mikroshēma ļauj iekārtai tik ātri secināt DNS, jo katrā iedobē var veikt atsevišķu ķīmisku reakciju.

Gēnu sekvencēšanā tiek izmantots fakts, ka abas DNS spirāles virknes ir komplementāras: no četrām ķīmiskajām bāzēm adenīns, guanīns, timīns un citozīns, kas katrā virknē ir savērtas dažādās secībās, adenīns savienojas tikai ar timīnu un guanīns tikai ar citozīnu. Visbiežāk izmantotajā sekvencēšanas tehnikā, kas balstās uz shēmu, kuru pirms 30 gadiem izstrādāja Kembridžas Universitātes Frederiks Sangers, DNS fragmenti tiek sadalīti atsevišķās virknēs un pakļauti brīviem nukleotīdiem, kas saistās ar oriģinālajiem As, Cs, Ts, un Gs, lai radītu jaunus papildu virzienus. Šo virkņu garums atšķiras, jo daži brīvie nukleotīdi ir modificēti, lai novērstu reakcijas turpināšanu; kad viena no šīm bāzēm saistās ar savu mērķi, ķēde pārstāj augt. Un katram no šiem četru veidu ķēdes terminatoriem ir pievienots atšķirīgs fluorofors, kas fluorescējas, kad uz to saskaras lāzera stars. Elektriskā strāva atdala dzīslas pēc izmēra, un lāzers nolasa krāsas, lai noteiktu, kura bija pēdējā katrai ķēdei pievienotā bāze, norādot secību. Lielākā daļa laboratoriju, kas mūsdienās veic sekvencēšanu, izmanto Applied Biosystems ražotu iekārtu, kas dienā izspiež aptuveni divus miljonus bāzu.

Jaunākais sekvencers no 454 var nolasīt 300 miljonus dienā.

454 metode ļauj izvairīties no vairākiem laikietilpīgākiem parastās secības posmiem, piemēram, šķipsnu atdalīšanu pēc izmēra. Atšķirībā no Sangera sekvencēšanas, tā nepārtrauc ķēdes: tā reģistrē bāzes, kad tās tiek pievienotas augošai daļai. Pirmkārt, DNS molekula tiek nejauši sagriezta dažādos garumos. Pēc tam katrs fragments tiek atdalīts atsevišķos pavedienos, un katrs tiek piestiprināts pie atsevišķas mazas lodītes. Bioķīmiskais process kopē atsevišķus pavedienus, tādējādi no katras lodītes izceļas 10 miljoni klonu. Pēc tam katra lodīte tiek iesaiņota vienā no 1,6 miljoniem aku. As, Cs, Ts un Gs secīgi mazgā iedobes, lai sintezētu jaunas komplementāras šķipsnas.

Lūk, patiesi gudrā daļa: izmantojot metodi, ko pirmo reizi aprakstīja Pols Nirēns un kolēģi Zviedrijas Karaliskajā Tehnoloģiju institūtā, 454 sekvencētājs uzreiz reģistrē, kad katrai daļai tiek pievienota bāze, izmantojot faktu, ka saistīšanās reakcija atbrīvo ķīmisku vielu, ko sauc par pirofosfātu. Iekārtas 454 iedobēs pirofosfātu uztver ķīmiskā kaskāde, kas beidzas ar enzīmu luciferāzi (kas dabiski sastopama ugunspuķēs), izstarojot gaismas uzliesmojumu. Standarta ar uzlādi savienota ierīce, kāda tiek izmantota digitālajās kamerās un teleskopos, nosaka katru zibspuldzi, katrā fragmentā nolasot As, Cs, Ts un Gs secību. Process var nolasīt aptuveni 200 līdz 300 bāzes pēc kārtas. Tāpat kā parastajā secībā, datori pēc tam meklē atbilstošas ​​secības viena fragmenta beigās un cita sākumā, saliekot fragmentus atpakaļ kopā pareizā secībā.

Sekvencerim, ko 454 laida tirgū 2005. gada oktobrī, bija daži nopietni ierobežojumi. Tas varēja nolasīt tikai 100 bāzes pēc kārtas (jo garāks ir bāzu posms katrā sekvencētajā fragmentā, jo vieglāk ir salikt pilnu genomu), un tam bija arī grūtības precīzi kartēt atkārtotus posmus — teiksim, sešas As atpakaļ. Bet Rotbergs saka, ka 454 filozofija bija Get it out agri; saņemt to pieņemts. Uzņēmums vispirms bija vērsts uz agrīnajiem lietotājiem, piemēram, Broad’s Lander, cerot, ka viņi drīz publicēs secinājumus, kas balstījās uz sekvencētāju. Vispirms jums ir jāsaņem agrīnie puiši, bet pārējie puiši, sekotāji, ir tur, kur ir tirgus, saka Rotbergs. Un viņi lasa recenzētus rakstus.

neandertālieši
Viens no agrīnā izmantotāja dokumentiem, kas saņēma plašu zinātnieku un sabiedrības uzmanību, bija neandertāliešu DNS pētījums, ko vadīja Svante Pēbo no Maksa Planka Evolūcijas antropoloģijas institūta Leipcigā, Vācijā. Neandertālieši, mūsdienu cilvēkiem vistuvākā suga, pazuda pirms aptuveni 30 000 gadu, un viņu ģenētiskās attiecības ar mums apvij vairāk pieņēmumu nekā faktu. Lai gan Pēbo bija veicis dažus iepriekšējos pētījumus ar neandertāliešu DNS, viss, kas nav tikai elementāras analīzes, izrādījās pārāk sarežģīts un dārgs. Problēma ir tāda, ka tūkstošiem gadu daži zināmie neandertāliešu DNS paraugi no fosilijām ir degradēti līdz īsiem fragmentiem, kas ir aptuveni 50 līdz 75 bāzes pāri. Turklāt DNS bieži ir piesārņota ar ģenētisko materiālu no mikroorganismiem un mūsdienu cilvēkiem, kuri ir apstrādājuši fosilijas. Taču Rotbergs uzskatīja, ka 454 mašīna var analizēt daudzas īsas secības par zemām izmaksām, radot pietiekami daudz informācijas, lai ļautu zinātniekiem izsijāt senos dārgumus no nevēlamā. Rotbergs auksti sauca Pābo, kurš piekrita sadarboties.

Pēc gēnu sekvencēšanas no 70 neandertāliešu kaulu un zobu paraugiem Pääbo komanda un pētnieki no 454 atrada vienu paraugu, kas tika lēsts 38 000 gadus vecs un kurā lielākoties bija tīra DNS. Kā viņi ziņoja rakstā, kas publicēts pagājušā gada rudenī Daba , viņi pēc tam sekvencēja vienu miljonu bāzes pāru no mazāk nekā 200 miligramiem materiāla, kas ir sasniegums, kas ir devis norādes par to, vai mūsdienu cilvēki un neandertālieši krustojas un kad abas sugas atšķīrās viena no otras. Vēl svarīgāk ir tas, ka dokuments parāda, ka ir iespējama visu trīs miljardu bāzu sekvencēšana neandertāliešu genomā. Tas varētu palīdzēt atrisināt tādus noslēpumus kā neandertāliešu ģenētiskā spēja runāt.

Noskaidrojot, vai cilvēki un neandertālieši krustojas vai pat spēja sarunāties, var iegūt lielu preses un sabiedrības uzmanību, taču citi īpaši ātras DNS sekvencēšanas pielietojumi varētu daudz vairāk ietekmēt medicīnu un mūsu dzīvi. Tradicionālā sekvencēšanas metode aplūko DNS no daudzām dažādām šūnām. Bet, ja viena no šīm šūnām ir, piemēram, audzēja šūna, tās secība var nedaudz atšķirties no veselo šūnu secības. Šādos gadījumos datori atlasa visbiežāk atrasto secību un atmet pārējās. Nākamās paaudzes sekvenceri, piemēram, tie, ko tirgo 454, tā vietā klonē un sekvencē atsevišķas DNS molekulas, ļaujot veikt īpaši dziļu zondēšanu, kas var atklāt retus variantus. (Tradicionālie sekvencētāji var analizēt arī atsevišķas molekulas, taču tas ir pārmērīgi dārgi.) Vienas molekulas sekvencēšanas ietekme uz medicīnu ir milzīga. Lai gan nav praktiski izmantot parasto sekvencēšanu, lai noskaidrotu DNS atšķirības starp veselām un slimām šūnām, jaunās iekārtas var viegli veikt šādus eksperimentus.

Metjū Meijersons, klīniskais patologs no Dana-Farber Cancer Institute Bostonā, ir publicējis pētījumu, kurā parādīts, kā 454 mašīna var palīdzēt atklāt mutācijas, kas saistītas ar plaušu vēzi. Tagad pieejamās plaušu vēža zāles ir vērstas uz Mejersona sekvencēto gēnu, un viņš cer, ka ārsti galu galā iegūs labāku izpratni par to, kurš reaģēs uz kurām zālēm, uzzinot, vai pacientam ir noteikta mutācija. Es domāju, ka pēc dažiem gadiem visiem vēža slimniekiem audzēji tiks raksturoti ar vienas molekulas sekvencēšanu, ja tehnoloģija turpinās samazināties, viņš saka.

Variācijā par šo tēmu Maikls Kozals, AIDS klīnikas speciālists Jēlā, ir pievienojies 454, lai veiktu īpaši dziļu HIV sekvencēšanu, lai noteiktu nelielu pret zālēm rezistentu vīrusu populāciju klātbūtni. Agrīnās metodes testos pacientiem tika atklāts aptuveni divreiz vairāk rezistenta HIV nekā Sangera sekvencēšana. Arī šī informācija varētu palīdzēt ārstiem individualizēt ārstēšanas shēmas, kas palielinātu izmaksu efektivitāti. Tas ir praktiski izdarāms mūsu sistēmā, saka 454 galvenais zinātnieks Maikls Egholms, kurš sadarbojas ar Kozalu. Iepriekš tas vienkārši nebija pieejams.

MyGenome
Džordžs Čērčs, Hārvardas Medicīnas skolas sekvencēšanas pionieris, saka, ka galvenais ir izmaksas. Tā kā to cenas nākamajos gados samazināsies, viņš saka, ka šīs mašīnas kļūs par demokratizējošo spēku, kas padarīs tradicionālos sekvencērus gandrīz novecojušus, līdzīgi kā personālie datori pārvieto lieldatorus. Un tas novedīs pie lietojumprogrammām, kuras neviens vēl nevar aptvert. Ja mēs joprojām strādātu ar lieldatoriem, daudzas interesantas lietas nenotiktu, viņš saka.

Čērča, kura bija starp desmitiem pētnieku, kas astoņdesmito gadu vidū ierosināja cilvēka genoma projektu, ir viens no retajiem biologiem, kura laboratorijas aprīkojumā ietilpst pie galda piestiprināts skrūvspīļu rokturis un urbjmašīna. Viņš izmanto šādu aprīkojumu, lai izveidotu savus nākamās paaudzes sekvencerus, no kuriem viņa laboratorijā pašlaik ir astoņi (sk. TR35, 2006. gada septembris/oktobris) . Pārliecināts, ka uzņēmumi iekasē pārmērīgu maksu par savām iekārtām, viņš vēlas brīvi dalīties savās zinātībās ar visiem ieinteresētajiem kolēģiem. Viņš salīdzina savu filozofiju ar wiki un Linux mentalitāti, sakot: ja sanāk skudru bars, tās var pārvietot gumijas koku.

Baznīcas lielā vīzija ir novirzīt lētos As, Cs, Ts un G plūdus uz to, ko viņš sauc par personīgo genoma projektu. Cilvēka genoma projektā pētnieki ieguva DNS no vairākiem cilvēkiem, no kuriem katrs privātuma apsvērumu dēļ paliek anonīms. Tātad pēdējā secība attēlo saliktu personu ar dažādu ģenētisko izcelsmi un medicīnisko vēsturi. Baznīca vēlas, lai viņa personīgā genoma projekts atšifrētu indivīdu DNS, kuri arī brīvprātīgi sniegs savus medicīniskos ierakstus. Visus iegūtos datus viņš ievietos internetā. Galu galā, viņš iedomājas, miljoniem cilvēku pievienosies projektam, ievietojot tiešsaistē savas secības, medicīniskos ierakstus un, ja izvēlēsies, pat sejas fotogrāfijas. Visa pasaule tad varēs piekļūt visiem datiem, kas tai nepieciešami, lai brīvi pārbaudītu hipotēzes.

Lai gan Baznīca ir saņēmusi ievērojamu finansējumu no Nacionālajiem veselības institūtiem, lai izstrādātu sekvencēšanas tehnoloģiju, personīgā genoma projekta izvirzītie ētiskie, juridiskie un sociālie jautājumi ir atturējuši NIH to atbalstīt, neskatoties uz pozitīvo dotācijas pieteikuma pārskatīšanu 2005. gada augustā. Tiklīdz es saņēmu apstiprinājumu, NIH kļuva sajūsmā, un ne vienmēr labā nozīmē, viņš saka. Viņš ir mēģinājis risināt privātuma un konfidencialitātes problēmas, norādot, ka neviena identitāte nav jāpublisko un ka NIH jau finansē cilvēka ģenētikas projektus, kuriem ir mazāk aizsardzības pasākumu.

Baznīca atzīst, ka intīmas zināšanas par viņu pašu DNS daudziem cilvēkiem var būt par daudz. Viņš saka, ka jūs neļaujat saviem bērniem pārlūkot interneta pornogrāfijas vietnes, un zināmā mērā jūs neļaujat sev pārlūkot visbriesmīgākās un rupjākās vietnes. Viņš sagaida, ka cilvēkiem tā vietā, lai piekļūtu neapstrādātiem genomiem, profesionāļi palīdzēs viņiem interpretēt informāciju.

Neraugoties uz federālā finansējuma trūkumu un ētiskiem iebildumiem, Baznīca turpina, būdama pārliecināta, ka sekvencēšanas tehnoloģiju attīstība virzīs ideju par personīgo genomu projektu uz priekšu — tāpat kā informācijas tehnoloģiju sasniegumi ir likuši svešiniekiem dalīties ar datiem veidā, par kādu neviens nav sapņojis. no brīža, kad Apple II ar divu diskešu piedziņu debitēja pirms 30 gadiem. Viņš uzskata, ka sekvencēriem kļūstot efektīvākiem un izmaksām turpina samazināties, personīgā genomika pieaugs tādā mērogā, kādu tikai daži cilvēki vēl ir iedomājušies.

Laimests loterijā
Pagājušā gada oktobrī X balvas fonds paziņoja par 10 miljonu dolāru balvu par ļoti precīzu 100 cilvēka genomu sekvenču izveidi 10 dienās vai mazāk, neiztērējot vairāk nekā 10 000 USD vienam genomam. Viens no pirmajiem dalībniekiem bija 454, kas plāno izstrādāt vēl mazākas lodītes, kas, cerams, ļaus tās iekārtām nolasīt vēl vairāk DNS vienā piegājienā par aptuveni tādām pašām izmaksām. Rotbergs saka, ka mums nav vajadzīga jauna fizika vai matemātika, lai sasniegtu 1000 USD genomu.

Atstājot malā jautājumu par to, kad vai kāds pretendēs uz X balvu, DNS sekvencēšanas cena noteikti turpinās kristies un palielinās precizitāte. Līdz pagājušajam gadam sekvencēšana patiešām cīnījās, lai ietekmētu nākamo genomikas laikmetu, kāds tai bija nepieciešams, saka Deivids Bentlijs, Illumina galvenais zinātnieks. Būtībā tradicionālās secības cena vienkārši nekrita pietiekami ātri. Tagad lauks ir daudz optimistiskāks nekā tas bija, viņš saka. Nākamās paaudzes sekvencēšanai ir liela nozīme.

Klausīties, kā zinātnieki atzīmē iespējas, ir kā klausīties loterijas uzvarētājus. Un personalizētā medicīna, piemēram, vēža pārbaudes un ārstēšanas veids, ko Dana-Farber’s Meyerson cer palīdzēt ieviest, ir tikai sākumpunkts. Bentlijs saka, ka jaunie sekvenceri atvērs logus plašajos genoma nekodējošos reģionos, kas ieslēdz un izslēdz gēnus. Egholms no 454 atzīmē, ka Cilvēka genoma projekts faktiski nesekvenēja katru pēdējo cilvēka DNS bitu; joprojām var būt neatklāti gēni, kurus var atrast papildu sekvencēšana. Broad’s Lander iztēlojas jaunas informācijas straumi par to, kas liek šūnai diferencēties vienā vai otrā veidā (galvenais noslēpums attīstības bioloģijā) un kas kontrolē dažādus šūnu stāvokļus. Es saprotu, ka to ir grūtāk izskaidrot nekā izārstēt vēzi, viņš saka, bet galu galā tas ir svarīgāk, jo tas ietekmēs visas slimības.

Landers prognozē, ka nākamā gada laikā zinātnieki varēs sākt pētījumus, kas ģenerē informācijas terabāzes — vienu triljonu As, Cs, Ts un Gs. Es nekad pat nerunāju vārdu terabāze pirms pagājušā gada, viņš saka. Un, ja visi šie dati ir tīmeklī un ir brīvi pieejami, tas novedīs pie pavisam cita veida bioloģijas.

Džons Koens, Sandjego dzīvojošais ārštata rakstnieks un korespondents Zinātne , strādā pie grāmatas, kurā aplūkotas ģenētiskās atšķirības, kas atdala šimpanzes no cilvēkiem.

paslēpties