Vienas DNS molekulas sekvencēšana

Uzņēmuma Helicos BioSciences biroja stūrī Kembridžā, MA, ekrānā uz ekrāna, kas izskatās pēc milzu ledusskapja, mirgo atpakaļskaitīšanas laiks: 10 dienas, piecas stundas un 51 minūte, līdz tiek pabeigta visu DNS secību nolasīšana. tajā ievadīts. Augstas caurlaidības iekārta, kas ir sarežģīta cauruļu, lāzeru un ķīmisko vielu konfigurācija, satur divas plāksnes, katrā no kurām ir iegravēti 25 mikrofluidiskie kanāli. Katrs kanāls spēj turēt un noteikt atsevišķu DNS paraugu. Paralēli sekvencējot paraugus, iekārtai ir nepieciešama tikai viena stunda, lai nolasītu 1,3 miljardus ķīmisko bāzu — pazīstamas kā A, C, T un G —, kas veido DNS virkni.

HeliScope ir pirmā komerciālā iekārta, kas sekvencē vienu DNS gabalu, nevis daudzkārt kopētu. Katrai plūsmas šūnai (iepriekš) ir 25 kanāli, no kuriem katrs spēj saturēt 16 miljonus DNS virkņu sekvencēšanai. Pārklājums uz šūnas virsmas ļauj to nomazgāt tīru starp reakcijām.

To sauc par HeliScope, un tas ir pirmais komerciālais instruments, kas var tieši nolasīt vienas šādas daļas secību, kas dod tam nepieredzēta ātruma potenciālu. Faktiski, saka Stīvens Kveiks, Stenfordas universitātes bioinženieris, kurš līdzdibināja uzņēmumu 2003. gadā, Helicos būtībā ir izveidojis pasaulē ātrāko DNS sekvencētāju. Lai gan nav skaidrs, vai iekārta radīs pilnu secību ātrāk nekā konkurējošās sistēmas (sekvencēšanas iekārtas ģenerētie dati joprojām ir jāanalizē un jāsavieno kopā, skaitļošanas ziņā ietilpīgs uzdevums), Quake saka, ka tā atver pilnīgi jaunas jomas pētījumiem.

Šis stāsts bija daļa no mūsu 2008. gada jūlija numura

• Skatiet pārējo izdevuma daļu
• Abonēt

HeliScope, kas tika prezentēts šī gada sākumā, pievienojas intensīvai sacensībai par ātrākām un lētākām sekvencēšanas tehnoloģijām. Cilvēka genoma sekvencēšanas cena pēdējos gados ir samazinājusies no 300 miljoniem USD, ko Cilvēka genoma projekts iztērēja pirmajam projektam, līdz mazāk nekā 100 000 USD. Lētas sekvencēšanas pielietojumi ir gandrīz neierobežoti, sākot no slimību diagnostikas līdz pētījumiem, kas varētu radīt mikrobus, kas izstrādāti biodegvielas vai zāļu ražošanai.

Citās pašlaik izmantotajās progresīvās sekvencēšanas tehnoloģijās, tostarp Illumina, Applied Biosystems un 454 Life Sciences tehnoloģijās (kuru Roche iegādājās pagājušajā gadā), sekvencējamā DNS ir jāpastiprina vai jākopē daudzas reizes; pēc tam kopijas tiek nolasītas vienlaicīgi, lai būtu vieglāk noteikt fluorescējošus signālus, kas norāda katra DNS burta atrašanās vietu. Vienas molekulas sekvencēšana izlaiž kopēšanas darbību, kas nozīmē, ka vienā sekvencēšanas eksperimentā var ievietot daudz vairāk unikālu paraugu.

Multivide

• Skatieties uzņēmuma Helicos Biosciences procesu vienas DNS molekulas sekvencēšanai.

• Stīvens Kveiks, Helicos Biosciences līdzdibinātājs, runā par sekvencēšanu.

Turklāt vienas molekulas sekvencēšana var radīt pilnīgāku genoma priekšstatu. Tas ir tāpēc, ka, pastiprinot DNS, dažas virknes, visticamāk, tiks veiksmīgi kopētas nekā citas, tāpēc tās, visticamāk, tiks attēlotas pēdējā secībā. Tāpat retas ģenētiskās mutācijas var palikt nepārstāvētas, jo tās netiek kopētas. Ja dienas beigās jūs varat vienkārši ievietot vienu DNS virkni uz platformas un to tieši secināt, tā ir milzīga priekšrocība, saka Elaine R. Mardis, Vašingtonas Universitātes Genoma centra līdzdirektore Sentluisā.

Nomodā naktī
Izmantojot Helicos tehnoloģiju, sekvencējamo DNS vispirms sasmalcina īsos apmēram 200 bāzu garos gabaliņos un ievada plūsmas šūnā, specializētā stikla priekšmetstikliņā. Plūsmas šūna ir pārklāta ar sīkiem DNS fragmentiem, kas ir paredzēti, lai aizķertu fragmentus, tiem peldot garām, noenkurojot tos vietā. Imobilizētie DNS gabali ir fluorescējoši marķēti, lai to atrašanās vietu fluorescences mikroskopā varētu ierakstīt ar kameru. Vienā sekvencēšanas eksperimentā var analizēt gandrīz miljardu DNS gabalu, salīdzinot ar aptuveni 400 000 līdz 50 miljoniem citu tehnoloģiju gadījumā.

Pēc tam plūsmas šūna tiek ievietota HeliScope, kur mikroskops atrodas 400 mārciņas Vērmontas granītā. Papildu svars neļauj vibrācijām traucēt signāliem, kas ierīcei ir jānosaka. Sarežģīta optiskā sistēma un cauruļu mudžeklis ieskauj mikroskopu, savienojot to ar tādu kā miniatūru ledusskapi, kas piepildīts ar pudelēm ar īpaši izgatavotām ķīmiskām vielām.

Kad zinātnieks aktivizē mašīnu, sākas precīzi horeografēta šķidrumu deja. Šūnā ieplūst ferments, ko sauc par DNS polimerāzi, un viena veida fluorescējoši iezīmēta bāze, piemēram, A. Enzīms liek tiem As ieņemt savas vietas augošajos DNS pavedienos, kas papildina paraugos esošās virknes. (Katru no četrām bāzēm var savienot pārī tikai ar vienu citu pamatni, tāpēc pievienotajam A ir jāatrodas pretī esošajam T un C pret G.) Kad fluorescējoši marķētā pamatne ir iekļauta jaunajā daļā, HeliScope kamera var pamaniet tā izstaroto gaismu. Attēlotājs nosaka spalvu — 200 nanometru gaismas konusu — no vienas [bāzes] integrācijas vienā DNS virknē, saka Stīvs Lombardi, Helicos prezidents.

Citas uzlabotas sekvencēšanas metodes izmanto līdzīgu pieeju, kas pazīstama kā sekvencēšana ar sintēzi. Bet atšķirībā no šīm tehnoloģijām HeliScope var atšķirt vienas bāzes nepastiprinātu fluorescējošu signālu, kas ieņem savu vietu augošā DNS virknē. Viena no šīs spējas atslēgām ir uzņēmuma izstrādātais nepiedegošais materiāls, kas pārklāj plūsmas šūnas virsmu un ļauj to nomazgāt starp reakcijām: atlikušās fluorescējošās bāzes apgrūtinātu precīzu atsevišķu sekvencēšanas reakciju noteikšanu. Jums ir jāpārliecinās, ka virsmai nepielīp papildu bāzes molekulas, saka Patriss Milošs, Helicos galvenais zinātniskais darbinieks. Šis bija viens no lielākajiem agrīnajiem izaicinājumiem. Pēc katra cikla fluorescējošie marķieri tiek nogriezti no tikko iekļautajām pamatnēm, un atlikušās ķīmiskās vielas tiek nomazgātas. Procesu atkārto secīgi ar katru no četrām bāzēm.

HeliScope katru sekundi ģenerē milzīgu daudzumu neapstrādātu datu. Ir vajadzīgas piecas līdz desmit dienas, lai nolasītu visu DNS, ko var ielādēt divās plūsmas šūnās; sekvencēšanai tie ir 400 miljoni DNS virkņu vienā šūnā, kas var ģenerēt 20 miljardu bāzu vērtu izmantojamu secību. Zinātnieki ielādē mašīnu, nospiež pogu uz tās sejas un aiziet. Bet sekvencēšanas apsēstie var izmantot internetu, lai nakts vidū pārbaudītu iekārtas gaitu, kas Helicos ir izplatīta parādība.

Kad HeliScope izveido savu fluorescences fotogrāfiju sēriju, pievienotais datu apstrādes centrs pārvērš tās burtu virknēs. Programmatūra salīmē šos gabalus kopā, lai izveidotu garāku secību.

Trūkst mutācijas
gadā publicētajā rakstā Zinātne Šī gada sākumā zinātnieki ziņoja par HeliScope izmantošanu M13 vīrusa genoma sekvencēšanai, kas ir svarīgs pierādījums tam, ka vienas molekulas sekvencēšanu var izmantot, lai nolasītu un apkopotu pilnīga genoma secību. (Apmēram 7000 bāzes pāru garš, vīrusa M13 genoms ir niecīgs — apmēram miljonā daļa no cilvēka izmēra.) Tehnoloģija ir tik jauna, ka vēl nav skaidrs, kādām lietojumprogrammām tā būs vispiemērotākā. Taču daži zinātnieki uzskata, ka vienas molekulas sekvencēšana varētu būt īpaši svarīga, lai izprastu, kā ģenētiskās variācijas veicina slimības. Galu galā dažas retas ar slimībām saistītas mutācijas iepriekšējos genoma pētījumos var būt izlaistas, jo tās netika kopētas amplifikācijas procesa laikā.

Helicos joprojām strādā pie šīs tehnoloģijas, izstrādājot ķīmiju, kas varētu palielināt sekvencēšanas reakciju ātrumu un ļaut plūsmas šūnai piestiprināt vairāk DNS gabalu. Kopā ar citiem galvenajiem spēlētājiem šajā jomā uzņēmums cer piegādāt pilnīgu genoma secību par USD 1000, un tas nozīmētu sākumu kaut kam pilnīgi jaunam medicīnā: indivīdu spējai piekļūt savai genoma informācijai.

Emīlija Singere ir BĒRNI biotehnoloģiju un dzīvības zinātņu redaktors.

paslēpties